传统的小分子抗癌药物的一个常见特点是其在水溶液中的溶解度差。为解决这一问题，通常会使用辅料来溶解不溶性药物，但这种策略可能会带来新的问题，比如所添加的溶剂本身具有毒性。例如，使用 Kolliphor EL（以前称为 Cremophor EL）将紫杉醇（Taxol®）制成乳剂，就曾与过敏反应和周围神经病变等副作用相关联。将抗癌药物与亲水性肽连接起来可以缓解这一溶解性问题，并为增加更多功能提供机会。在本文中，我们将介绍两种常用的能够增强药物递送的肽类型——整合素靶向肽和细胞穿透肽，并讨论水溶性 PDC 在诊疗应用中的应用。
1. 整合素靶向肽-药物偶联物
鉴于将化疗药物递送至病变部位，对健康组织造成最小附带损伤（一处或多处）这一目标，有效方法是考虑正常组织/细胞与肿瘤之间的差异。任何癌组织中异常表达的受体为靶向递送提供了靶点。因此，可在PDC设计中整合多种靶向基团，以实现对特定细胞类型的特异性靶向。在已识别的受体中，整合素被广泛使用，因为它们对于组织的生理发育、维持和修复至关重要，并且在多种疾病的病理过程中，尤其是癌症中起着重要作用。因此，在过去的二十年中，设计出了各种整合素靶向肽-药物偶联物，其中αvβ3-targeting精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）基序几乎无处不在。例如，将RGD4C的游离羧基与阿霉素（DOX）的3'-氨基位置偶联，得到的偶联物在体内对肿瘤生长和转移的抑制效果优于游离DOX。更重要的是，在体外组织病理学检测中，这种前药对肝脏和心脏的毒性似乎低于游离DOX。然而，他们并未阐明所报道的效果是源于偶联物还是释放的DOX。为了实现药物在癌细胞中的优先释放，Ryppa及其同事在阿霉素（DOX）和二价RGD肽模拟物之间引入了一个可被金属蛋白酶2/9（MMP-2/MMP-9）切割的八肽片段E-[c(RGDfK)2]。，观察到与酰胺键连接的对照相比，药物释放显著增加。然而，该偶联物在相对较低剂量下几乎没有或仅有中等的抗肿瘤效果，需要更高剂量才能发挥显著作用。低效性可能源于药物释放不足，因为只有在进一步发生切割后的水解作用后才能回收到游离的阿霉素。除了阿霉素，紫杉醇（PTX）和喜树碱（CPT）也已与整合素靶向肽偶联，显示出与游离药物相当的体外抗癌效果。尽管这些实例中的肽序列各不相同，但它们都表明偶联方法对所得药物-肽偶联物（PDC）的疗效至关重要。紫杉醇和喜树碱通常通过酯键形成与肽偶联，而阿霉素则是通过酰胺键形成。由于酰胺键比酯键对水解的稳定性显著更强，通过酯键连接的药物在生理环境中会更容易降解，从而释放出游离药物。因此，释放通过酰胺键连接的药物则需要更多的复杂步骤或采用其他策略。
展开剩余85%2. 富含胍基的肽-药物偶联物
在自然界中，生物屏障对于所有生命系统来说都是必不可少的，它们将细胞内的结构与潜在有害的环境和病原体隔离开来。尽管这些屏障对于生存至关重要，但其固有的排他性可能会限制或阻碍多种药物的吸收。因此，药物递送研究的一个重要领域是寻找能够增强药物内化能力的解决方案。在早期关于这一主题的研究中，大多数研究旨在寻找或开发具有合适亲水亲油平衡的药物，使其能够穿过细胞的非极性膜。通常，这需要调整药物的物理性质以优化其 log P 值，其中 P 是分配系数，用于衡量药物的亲脂性。实际上，这是一项耗时且性价比低的任务。与专注于药物的调整不同，Wender 及其同事致力于通过了解这些天然屏障并开发突破它们的工具或策略来寻找全新的进入途径。
精氨酸而非赖氨酸的识别及其数量和空间排列是使Tat49–57肽（HIV-1Tat蛋白的一个碱性结构域）能够被细胞快速摄取的关键特征，这一发现意义重大。基于此，Wender及其同事开发了富含胍基的分子转运体，并展示了其在多种应用中的用途。例如，环孢素A（CsA）被选为候选药物，因为它对多种皮肤疾病有效，但全身给药时会产生脱靶毒性。由于CsA本身无法穿透皮肤，为解决这一问题，他们通过一个pH敏感的连接子将一个七聚精氨酸与CsA连接，从而制备出R7–CsA。与未修饰的CsA相比，局部应用的R7–CsA能够有效地进入小鼠和人类皮肤细胞，到达真皮T淋巴细胞并抑制皮肤炎症。这为增强难以吸收的药物跨组织屏障的传递提供了一种通用策略，并为炎症性皮肤疾病的局部治疗提供了新的途径[58]。在另一个例子中，Wender及其同事拓展了这种方法，以帮助递送细胞不可渗透的八肽ψϵRACK，这是一种已知的ϵ蛋白酶C同工酶激动剂，能够减少心肌细胞缺血引起的损伤。与R7结合后，所得的PDC能够轻易进入心肌细胞，并在完整的心脏中递送，无论是在缺血损伤之前还是之后，都能减少缺血损伤。有趣的是，这种配方的表现显著优于由HIVTat和Antennapedia衍生的转运蛋白与ψϵRACK的结合体。进一步的研究表明，与富含胍基的肽结合后，某些药物甚至能够突破研究较少的生物屏障，例如刚地弓形虫速殖子和莱茵衣藻。然而，随之出现的一个问题是，货物（环孢素A、ψϵRACK）释放速率的提高是以货架稳定性差为代价的。为了解决这个问题，研究人员对生物可激活部分进行了研究，以通过酶作用（酯酶、磷酸酶或蛋白酶）或细胞内氧化还原事件实现触发释放。他们通过二硫键将货物连接到运输器上，这种键在遇到细胞内的谷胱甘肽时会断裂。荧光素被选作药物替代品来模拟药物的摄取、释放以及与细胞内靶点的相互作用，因为它每分子能产生一个光子，这使得研究人员能够量化细胞和动物体内实时的摄取和释放情况。
在体内应用富含胍基的肽-药物偶联物时，很容易想象到其会被血液中的蛋白质吸附，从而导致药物迅速从体内清除。最近，张及其同事报道了他们为解决这一问题所做的努力。他们利用2,3-二甲基马来酸酐（DMA）与伯胺的开环反应，报道了一种可激活的细胞穿透肽-阿霉素（DOX）偶联物（DOX-CR8G3PK6-DMA），用于肿瘤靶向药物递送。在生理pH值7.4时，DMA屏蔽基团通过分子内静电作用阻断了多阳离子细胞穿透肽（R8）的细胞穿透功能。而在肿瘤细胞外pH值6.8的条件下，DMA发生水解，导致R8的细胞穿透功能恢复，细胞摄取增强。体内实验结果表明，这种肽类前药能够显著抑制肿瘤生长。该团队还将这一策略应用于一种MMP-2敏感的可激活细胞穿透肽（R9GPLGLAGE8）与原卟啉（PpIX）的偶联物，用于肿瘤靶向光动力治疗。与DMA的例子类似，静电作用力使得屏蔽基团在生理条件下保持细胞穿透肽的功能处于抑制状态，而在肿瘤微环境的低pH值条件下，屏蔽基团被去除，细胞穿透肽的功能得以恢复。阳离子R9和阴离子E8段会阻断正常组织中的细胞穿透功能。在肿瘤部位，当暴露于过表达的MMP-2蛋白酶时，寡肽连接子（GPLGLAG）会在穿膜肽和聚阴离子肽之间发生蛋白水解，从而释放出用于光动力疗法（PDT）的CPP-PpIX。他们发现，释放出的CPP-PpIX能够有效地在肿瘤部位聚集，并显著抑制实体瘤的生长。
富含胍基的分子转运体能够极大助力的一个领域在于克服肿瘤中多药耐药性（MDR）的出现。MDR 是许多癌症化疗药物失效的主要原因，尤其是在初次治疗后复发时。其中一种耐药机制是膜蛋白表达增加，这些膜蛋白介导单向能量依赖性药物外排，比如 P-糖蛋白（Pgp），它能在药物到达细胞内靶点之前拦截并将其排出。这种耐药性在通过多种靶点和途径发挥作用的广泛药物类型中均有观察到。此外，由一种药物诱导的耐药性往会导致对多种药物的交叉耐药性。对多种药物的耐药性进一步限制了复发性癌症的治疗选择.
富含胍基的 PDC 可以帮助克服这些外排蛋白，因为它们的内化过程不涉及药物进入细胞的被动扩散机制，因此可以避免 Pgp 介导的药物排出。尽管这为克服多药耐药性提供了合理的依据，但其整体效果仍取决于药物进入细胞后释放的效率。为了证明这一策略，Wender 及其同事通过生物可还原连接子将一种代表性的小分子治疗剂（紫杉醇）与八精氨酸肽转运体连接起来，生成的偶联物对单独使用该治疗剂耐药的恶性细胞表现出显著增强的活性（图 2）。他们进一步证明，这种方法在卵巢癌的动物模型中有效，并使用 Pgp 底物水母素探索了这种效应的普遍性和机制基础。尽管水母素本身由于 Pgp 外排而无法进入细胞，但其八精氨酸偶联物却能轻易进入。这种总体方法有助于克服小分子癌症化疗药物引发的多药耐药性，并能改善许多癌症患者的预后。鉴于其潜在的外排敏感性可以被规避，这种方法还从根本上改变了寻找对耐药疾病有效的新型治疗药物的方法。
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图2 温德的细胞穿透肽偶联策略以克服多药耐药性。脂溶性药物作为 Pgp 外排的底物，在与分子转运体偶联后变得高度水溶，并能够迅速进入细胞，而不被原本会将其排出的 Pgp泵识别。
最近，崔及其同事展示了一个有趣的发现，即抗癌药物DOX与Tat肽的N端或C端连接，会对它们在细胞中的摄取以及对药物敏感和耐药癌细胞的细胞毒性产生显著影响。具体而言，他们观察到两种细胞系对C端偶联物的细胞摄取量均高于N端类似物。此外，C端偶联物部分克服了宫颈癌细胞的多药耐药性，而N端偶联物与游离DOX相比，细胞毒性没有显著提高。他们还揭示，N端和C端偶联物都提供了一种机制来规避与多药耐药性相关的药物外排。这表明偶联药物的位置会影响PDC的整体行为。对PDC分子结构的进一步修饰也可能导致其行为发生变化。例如，张等人报告称，在Tat-DOX偶联物的Tat序列附近共价连接一个疏水单元，可进一步提高亲本偶联物在癌细胞中的细胞摄取，而不论未偶联分子的膜通透性如何。在Tat-DOX偶联物的情况下，偶联额外的疏水部分（在这种情况下为棕榈酰化）提高了该偶联物在对药物敏感和耐药的宫颈癌细胞系中的抗癌活性。他们认为，通透性的增强是由于脂质尾部模拟了Tat蛋白上的疏水区域。
富含胍基的肽类物质的利用提供了一种有效的方法，能够使原本无法穿透细胞膜的药物得以跨膜转运，并且能够规避现有的多药耐药机制，否则这些机制会将细胞毒性药物排出。显然，这类连接物对于癌症治疗来说是一种很有价值的工具，但其高度带电的特性给其广泛应用和临床转化带来了难题。针对这一问题，人们正在开发应对策略，张的研究方法就是一个很好的例子，展示了未来可能的发展方向。
3. 治疗诊断肽-药物偶联物
尽管肽-药物偶联物已被证明能提高游离药物的疗效，但阐明偶联药物在细胞内化后何时以及如何释放的难题依然存在。为了监测这一重要过程，可将荧光探针整合到肽-药物偶联物中。然而，传统的荧光分子通常会受到聚集诱导猝灭的影响，这种众所周知的效应限制了它们的标记效率或浓度以达到所需的灵敏度。最近出现的具有聚集诱导发光（AIE）特性的荧光团为解决这一难题提供了及时的方案。将 AIE 荧光团（AIEgens）整合到“点亮”探针中，相较于传统的“始终开启”探针，具有诸多优势，包括低背景干扰、高信噪比（SNR）、出色的光稳定性以及可激活的治疗效果，并且与肽-药物偶联物结合使用，可提供一种强大的体外药物释放特性测定方法。
在构建这些诊疗结合体之前，张等人测试了四苯乙烯（TPE）与不同数量亲水性氨基酸（如天冬氨酸（D））共轭的光学特性，以揭示肽设计对调整AIEgen荧光的重要性。他们的结果表明，至少需要五个D残基才能关闭TPE共轭物的荧光。基于这一关键发现，设计了一种基于铂（Pt）的前药的诊疗探针，用于追踪靶向细胞中的药物递送/释放，并随后对药物激活诱导的细胞凋亡进行成像（图3）。具体而言，在铂（IV）前药的两个轴向位置上，分别用αvβ3整合素靶向肽cRGD和由AIEgen四苯基硅（TPS）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶酶特异性天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸（DEVD）肽组成的细胞凋亡传感器进行功能化。在整合素过表达细胞的选择性摄取后，该探针被抗坏血酸或谷胱甘肽等还原剂还原，生成分离的TPS-DEVD和铂（II）物种。释放的有毒铂（II）物种诱导细胞凋亡，导致荧光增强。半胱天冬酶的表达激活了TPS-DEVD探针，从而产生发光反应。此外，在U87-MG人脑胶质母细胞瘤癌细胞中，由细胞凋亡诱导的荧光强度与前药浓度和细胞活力之间存在良好的相关性。这些结果表明，内置细胞凋亡传感器的诊疗药物递送系统能够快速评估药物递送的有效性和相关的治疗反应，这对于指导治疗决策（例如治疗是否成功）至关重要。
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图 3. 具有内置聚集诱导发光（AIE）点亮凋亡传感器的靶向诊疗铂（IV）前药示意图，用于非侵入性原位早期评估其治疗反应
虽然基于AIE的探针对于评估治疗效果很有用，但它无法提供有关药物激活过程的任何信息，除了药物必须已被释放才能诱导观察到的细胞凋亡这一事实。为了捕捉Pt（IV）前药激活的动态时刻，设计了一种靶向特异性探针，将四苯乙烯吡啶鎓（PyTPE）直接与Pt（IV）前药和cRGD共轭。与前一个例子不同，在Pt（IV）和cRGD之间插入了五个Ds单元，以赋予探针高水溶性，从而防止聚集。在选择性内化到整合素过表达的细胞后，Pt（IV）前药的还原释放了高发光的PyTPE残基，从而提供了具有高信噪比的点亮响应，因此为定量分析前药激活生成活性Pt（II）药物提供了一种可靠的方法。值得注意的是，由于MDA-MB-231细胞中整合素的表达水平远高于MCF-7细胞，因此在MDA-MB-231细胞中始终观察到更显著的细胞死亡。最近，金和季利用TPE的发光特性设计了一种多功能吉西他滨（GEM）前药TPE-GEM-RGD，该药物可用于细胞内靶向发光成像，并在细胞内还原环境中选择性释放GEM[82]。他们展示了TPE-GEM-RGD成功用于细胞内发光成像以及对谷胱甘肽（GSH）响应性释放吉西他滨以抑制胰腺癌细胞增殖。值得注意的是，在该系统中，GEM不仅作为药物发挥作用，还增强了分子的水溶性。
目前，化疗中常用的单一药物通常由于目标癌细胞中已有的或新出现的耐药性而无法完全消灭所有癌细胞。因此，非交叉耐药的抗癌药物已被广泛用于高效的癌症治疗。基于这些考虑以及他们之前对聚集诱导发光（AIE）的研究，唐和刘的研究小组利用这一策略构建了一种新型的诊疗探针，该探针同时包含顺铂和阿霉素，可用于双药追踪以及监测目标细胞中的药物激活情况。体外实验结果表明，这种前药能够选择性地杀死过表达整合素受体的癌细胞，而对正常细胞无损害。此外，顺铂和阿霉素的同时激活产生了协同抗癌效果。
监测药物激活的第二种直接方法是将猝灭剂连接到荧光药物上以消除其荧光发射。当供体与受体（药物与猝灭剂）分离时，药物的荧光得以恢复，从而产生可观察到的信号。最近，洛克等人报道了一种新型的酶特异性阿霉素（DOX）药物信标，可用作耐药性诊疗分子探针[84]。更具体地说，通过赖氨酸连接将抗癌药物阿霉素与黑洞猝灭剂（BHQ-2）和细胞穿透肽（八精氨酸，R8）共价连接，得到了药物信标R8DB。为了在作为组织蛋白酶B（CatB）传感器的同时调节阿霉素的释放，在阿霉素和BHQ-2之间插入了可被酶切割的四肽GlyPheLeuGly（-GFLG-）。正如预期的那样，在加入外源性CatB后，阿霉素的荧光得以恢复，这意味着药物信标的设计并未影响CatB对GFLG底物的切割特异性。这进一步表明，CatB酶对药物荧光的特异性激活可作为细胞内追踪和/或CatB检测的线索。在耐药性卵巢癌细胞系（NCI/ADR-Res细胞）中进行的进一步细胞实验表明，R8DB药物信标在细胞内显示出比游离DOX强得多的红色荧光，这表明其既有效进入细胞内，又激活了组织蛋白酶B。这些结果与之前关于富含胍基的肽-药物偶联物的研究一致，在该研究中，通过R8进行功能化的偶联物能够克服多药耐药性[50]。此外，与相同浓度的游离DOX相比，这种诊疗信标对NCI/ADR-Res细胞的细胞毒性更高。这些令人兴奋的结果表明，将荧光药物纳入信标设计中开辟了一个新的平台，以探索治疗剂的诊断功能。这种协同效应有可能减少肿瘤诊断位置与实际药物递送位置之间的差异，这是当前治疗模式中的一个重要挑战。
最近，张及其同事利用双福斯特共振能量转移（FRET）技术展示了一种有趣的前药（V-前药），其中5(6)-羧基荧光素（FAM）和阿霉素（DOX）的荧光均可被4-二甲氨基偶氮苯-4-羧酸（Dabcyl）有效猝灭。阿霉素和FAM分别通过酸不稳定的（腙）和半胱天冬酶-3可切割的（DEVD）连接子进行偶联，并且引入的RGD靶向基团能够选择性地与过表达的αvβ3整合素的癌细胞结合。V-前药的酸介导的阿霉素释放与DOX红色荧光的增加相关联，从而能够实时评估其释放情况。随后监测FAM荧光恢复（黄绿色）则提供了DOX诱导细胞凋亡的信息，因为半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达增加会通过裂解DEVD连接子释放FAM。此外，细胞实验表明，与游离DOX相比，V前药的药理学特性没有显著变化，因为在酸性环境中腙键的裂解会释放未修饰的DOX。张的平台展示了诊疗一体化的潜力，特别是实时药物释放和随后细胞凋亡的级联成像为评估癌症对药物的反应以及原位评估前药的治疗效果提供了机会。所获取的治疗信息可能会揭示针对某种疾病的优化治疗策略，并使个性化药物在不久的将来得以出现。然而，其V前药的体内应用目前受到荧光信号组织穿透能力低以及可见光谱区域组织背景噪声的限制，尽管在文献中可以找到使用DOX和具有类似荧光特性的荧光团的良好体内应用实例。体内成像仪器（如背部皮肤窗口室）的发展将扩大这些偶联物在治疗决策和个性化癌症治疗指导方面的体内应用。
参考文献：doi.org/10.1016/j.addr.2016.06.015
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